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SidM又名DrrA，是一个多功能效应因子，同时具有GEF和GDF活性，并对Rab1高度专一性识别，其独特性引起了广泛关注，是目前研究最为深入的效应因子。SidM含有3个相对独立的结构域。其N端(1-339 aa)为ATase (Adenylyltransferase)结构域，起到对Rab1的修饰作用[11]；中间(340-520 aa)是一个GEF结构域，负责对Rab1的激活；敲除SidM能够明显降低嗜肺军团菌对野生型Rab1的俘获效率[12-13]；C端(521-647 aa)为P4M结合域，介导SidM在LCV的锚定[14]。一旦被分泌，SidM可通过PI-4P锚定至LCV外膜，通过其多功能的GDF/GEF活性，促使宿主胞内活性关闭状态的GDI-Rab1-GDP复合物发生解离，并完成GTP对GDP的取代[15]，使Rab1转化为活性开放状态并通过其自由的异戊二烯化修饰的C端结构域插入LCV外膜，帮助实现LCV对Rab1蛋白的俘获和积累。对SidM的N端9-218 a段的三维晶体结构的解析，意外发现该区域的高级构象与可行使AMP共价修饰的GS-ATase的C端结构域具有高度同源性，通过小分子结合力实验证明，SidM是Rab1专一性的AMPylase，该区域的腺昔酰化(Adenylylation/AMPylation)基序(G-Xll-D-X-D)，可以ATP为底物，将1分子的AMP修饰到处于激活状态的GTP-Rab1的第77位酪氨酸上[9]，完成腺苷酰化的过程；同时，AMPylation过程也对Rab1在LCV膜上的锚定至关重要[16]。最新研究已证明，无论Rab1结合的是GDP还是GTP，SidM对Rab1第77位Tyr的腺苷酰化修饰(Adenylylation)，都可保证Rab1处于active的折叠构象，从而最大限度地保证被俘获的Rab1在LCV上保持活性开放状态[17]。SidM同时具有对宿主Rab1蛋白的GEF/GDF/AMPylase的功能，能够多环节参与LCV对Rab1的俘获和激活，对这一独特效应因子的发现、结构解析和生化功能的研究历程，均为深入了解病原菌-宿主相互作用分子机制提供了宝贵的研究范例。
LidA是最早被明确鉴定的Dot/Icm效应因子之一，基因全长2 187 bp，编码729个氨基酸。与SidM相似，LidA也参与了对Rab家族的识别和俘获[8,18]；不同的是，LidA可独立招募不与GDI结合的Rab1-GDP[12]，且LidA对Rab家族具有多样识别性，体内可至少识别Rab1、Rab6和Rab8等3种以上的Rabs[8,19]。我们于2012年公开发表的LidA与两种状态的Rab1蛋白复合物的三维晶体结构，揭示了LidA可独立俘获GDI-free-Rab1的分子机制[20]。复合物状态下，LidA (224-559 aa)的coiled-coil结构域可以一种独特的紧密结合方式识别并牢牢结合不同状态下的Rab1，包括Rab-GDP和Rab1-GTP，其coiled-coil结构域极似4个“手指”，将球状的Rab1蛋白抓握于“掌心”中，这种独特的大面积抓获式互作方式，导致了LidA对Rab1蛋白具有极高的相互识别和互作力，通过体外ITC (等温滴定微量热仪)检测，二者的解离常数(KD值)达到纳摩尔级别，比常规的小分子之间的解离常数低了3-4个数量级，因此可竞争性结合GDI-free-Rab1[18]；体外质谱实验也表明LidA还能高效识别经SidM腺苷酰化的Rab1，但并不参与该过程，表明LidA可能具有和SidM的N端结构域相似的功能，可维持Rab1持续保持活性开放状态。特别的是，我们发现LidA-Rab1-GDP复合物中本应inactive的Rab1，折叠方式与active状态的Rab1-GTP几乎完全一致，体外ITC实验也表明，LidA对Rab1-GDP和Rab1-GTP的识别能力几乎相当。因此，尽管没有检测到LidA具有任何与Rabs相关的酶活性，LidA仅凭借其自身独特的折叠方式，即可实现对球状Rabs蛋白极强的亲和力，能够保证Rab1不被宿主胞内的GDI回收，有利于其后续的激活和磷酸化，并能维持其活性开放状态，从而保证LCV对宿主Rab家族成员的高效俘获和活性稳定。LidA (201-583)-Rab8-GTP的复合物晶体[21]结构与我们解析的LidA (224-559)-Rab1的结构高度相似，表明LidA可能以相似的机制在宿主胞内识别不同的Rab家族成员。同时，我们的工作也证明了，LidA体外可识别Rab1、Rab2、Rab4、Rab5、Rab6、Rab7、Rab8、Rab9、Rab11、Rab14、Rab18、Rab20、Rab22等13种Rabs[20]。目前，我们正致力于从结构解析的角度揭示LidA对Rabs家族广泛却又带有选择性的识别机制。
LepB全长基因编码了1 294个氨基酸，在嗜肺军团菌通过SidM俘获Rab1的过程中，可检测到LepB在LCV膜上大量积累长达12 h[9]。尽管LepB在一级序列及空间结构上，均与经典的GAP结构域(TBC family，Tre/Bub2/Cdc16)没有同源性[22]，却被证明其在宿主体内可充当Rab1的GAP[9]，在宿主细胞中Rab1不足的情况下，SidM和伪装成GAP的LepB协作，迅速把激活状态的Rab1-GTP转化为Rab1-GDP，使Rab1脱离LCV回到细胞质中，协助军团菌完成对Rab1的俘获和膜循环的调控。LepB的GAP结构域与Rab1-GDP复合物的三维晶体结构表明，其行使GAP的分子机制不同于经典的TBC结构域[23-25]。复合物晶体结构揭示了LepB对Rab1-GTP的水解机制，LepB通过其444位的Arginine finger而非传统的Glutamine finger作用于Rab1的DXXGO motif的Cis-Glutamine，表明LepB采用了类Ras/Rho GAP-like的而非TBC-like的催化机制完成对Rab1上GTP的水解[24-25]；同时，Rab3、Rab8、Rab13和Rab35均可作为LepB的催化底物，且在军团菌感染过程早期，可在LCV膜上检测到Rab8的积累。因此，LepB可能也是军团菌俘获Rab8过程的GAP[23]。LepB对Rab1的识别能力不仅强于经典的哺乳动物来源的TBC GAP，也远强于细菌来源的VirA/EspG Rab GAPs[24]，且识别机制与以往鉴定的所有GAP都存在较大差异，证明来自病原菌的RabGAPs催化机制具有多样性。
然而，目前已经解析的LepB的晶体结构集中在N端，单体结构最长为1-618 a段[25]，复合物结构也多集中在313-618 a段之间[23-24]。作为一个编码多达1 294 aa的大分子量蛋白，LepB尚有除GAP之外的重要功能。在嗜肺军团菌感染末期，LepB可参与调控宿主细胞裂解，诱导宿主细胞凋亡[26]；在时空表达上，LepB在嗜肺军团菌感染伊始即可分泌，在LCV上的表达时间可长达12 h[9]；双敲除LepA和LepB的嗜肺军团菌，无法裂解阿米巴宿主细胞[26]，表明LepB在原生动物细胞裂解过程中发挥了极其重要的作用，并非和大多数效应因子一样，为嗜肺军团菌编码的功能冗余效应因子。我们对其全长蛋白的二级结构预测也表明，LepB的C端结构域具有和LidA相似的长coiled-coil结构域，体外能够识别多种Rab GTPases家族成员，且全长蛋白呈现出令人意外的高可溶性。因此，对其C端结构域的结构解析和功能测定，以及其选择性识别多种Rabs的分子机制的研究工作，是本研究小组目前亟待解决的问题。
Ankx又名LegA8或AnkN，是由军团菌编码的含有真核基因特有基序的效应因子，其独特之处在于全长序列中包括了4个ARHD (Ankyrin repeat homology domains)结构域，以及1个Fic (Filamentation induced by c-AMP)功能域[27-28]。AnkX可通过其Fic功能域AMP化(AMPylation)宿主蛋白的酪氨酸和苏氨酸，干扰宿主胞内体转运[27]。Mukherjee等[29]发现，在SidM对Rab1进行AMP修饰的过程中，AnkX可同时对Rab1进行磷酸胆碱化修饰，即以胞苷二磷酸盐胆碱(GDP-choline)为底物，将磷酸胆碱基团转移至Rab1的Ser76上。最新研究结果[30]则证明AnkX只对Rab1-GDP进行磷酸胆碱修饰，通过这种修饰促进SidM介导的Rab1和GDI的解离[31]；同时，AnkX还能修饰Rab35，表明它对宿主的胞吞和胞吐途径均具有调控作用，其功能的发挥取决于其Ficmotif上保守的组氨酸[29]。AnkX利用其真核特有的Fic基序介导对宿主蛋白的翻译后修饰过程，也证明了军团菌能够利用自身编码的独特效应因子干扰宿主囊泡转运过程。Lem3与AnkX毗邻，且位于它的下游。研究结果显示，Lem3具有去磷酸胆碱化活性，是一个去磷酸胆碱酶(De-phosphocholinase)，可以将磷酸胆碱从Rabl上移走[30]，从而实现对Rabl的调控，所起作用正好与AnkX相反。
SidD是近期发现的能够负调控Rab1蛋白AMPylation修饰的效应因子，与SidM作用相反。Neunuebel等[32]通过在军团菌基因组上搜索SidM的相邻基因，发现了与sidM相毗邻的sidD基因，并通过检测其去腺苷酰化(De-AMPlyase)活性，证明了SidD具有与SidM相反功能的推测。Tan等[11]则在酵母体内通过筛选能够抑制SidM (1-339 aa)毒性的转化株，发现这些酵母株均能编码SidD基因，该基因可消除SidM (1-339 aa)对酵母菌株产生的细胞毒性，并能高效移除Rab1-AMP上的AMP基团。两个研究小组均通过逆向思维的巧妙方式找到了军团菌去AMPylation修饰的效应因子，进一步完善了LCV俘获和修饰Rab1的分子机制。SidD与磷酸酶在蛋白二级结构上具有高度相似性，三维晶体结构表明SidD的结构与PPMs (Metal-dependent protein phosphatases)结构域具有类似的折叠方式，其第92位和110位的天冬氨酸对其酶活性起关键作用[33]，其高分辨率晶体结构还发现SidD催化口袋含有双核金属离子结合位点，依赖于镁离子催化对AMP的水解反应[34]。研究证明，只有经SidM催化的被AMPylation的Rab1是SidD的特异性底物，且只有经过SidD的去修饰，Rab1-GTP才能有效地被LepB识别，从而帮助军团菌完成对宿主Rab1膜循环的调控[32]。体内研究也证明了SidM和Rab1在感染初期的2 h之内完成在LCV上的累积，LepB的峰值则在4-9 h[9]，表明了这几种效应因子的调控秩序。Neunuebel等[32]同时证明AMP的修饰和去修饰是处于动态变化的，且SidD的时空表达与LepB相一致，提示SidD介导的De-AMPylation可能与Rab1的失活和释放有关。有意思的是，Rab35同时也可充当AMPylation及De-AMPylation反应的底物，但Rab2、Rab4、Rab6、Rab8、Rab14和Rab15均不参与SidM介导的AMPylation反应，提示这两种效应因子可能也参与调控军团菌逃避宿主溶酶体降解的过程。
RalF是第一个被明确鉴定的Dot/Icm分泌系统效应因子，能够与宿主胞内的腺苷酸核糖基化因子1 Arf1(ADP ribosylation factor 1)相互识别[35]。RalF是通过比对嗜肺军团菌基因组中和真核细胞腺苷酸核糖基化因子Arf1的GEFs同源基因时发现的。Arf1是一种小G蛋白，负责调控宿主胞内COPI囊泡从高尔基体运回内质网的过程。Arf1的激活依赖于其GEFs上一段约200个氨基酸的保守Sec7结构域。RalF的晶体结构[36]表明，其N端含有一个与Sec7高度同源的结构域，可在宿主胞内充当Arf1的GEF，识别并激活Arf1，利用Arf1将本应从高尔基体运送至内质网的COPI囊泡俘获至LCV上，从而调控宿主胞内内质网到高尔基体的囊泡转运过程；该过程还涉及了另外两种效应因子SidC和SdcA，SidC的N端晶体结构呈现一种全新的折叠方式，可辅助RalF识别Arf1[37]。
效应因子VipA、VipD、SidC、SidE、SidJ、LseA、PieE、LegG1、RidL和YlfA/LegC7等也被证明参与调控宿主的囊泡转运过程。目前已知VipA在军团菌感染过程中可作为Rab5、Rab21和Rab22的GEF[38]，参与肌动蛋白的结合与聚合，进而调控宿主的囊泡转运过程[39]；VipD可以与激活状态的Rab5或Rab22结合[40-41]，阻止这些小G蛋白进入正常的膜循环，从而干扰宿主的内体转运过程，抑制宿主胞内的溶酶体成熟[42]。SidC[43]、SidE和SidJ[44]可帮助LCV募集内质网来源的囊泡[45]。LseA、LepB和IcmG等效应因子的二级结构中均具有和SNARE-like motif同源的结构域，因此可能在SNARE介导的膜融合过程中发挥作用[3]，目前已证明LseA能够识别宿主来源的SNARE并参与调控高尔基体转运过程[46]。PieE也被证明能够识别宿主胞内的多种Rab GTPase，如Rab1、Rab2、Rab5、Rab6和Rab10[5]。LegG1则可作为Ran GTPase的激活因子，通过调控宿主胞内的微管顺向聚合抑制吞噬体的转运[47]。RidL则在宿主胞内通过结合Vps29抑制囊泡逆向运输(内体-高尔基体)过程，保证军团菌在宿主胞内的大量复制[48]。在酵母菌株Saccharomyces cerevisiae体内过表达YlfA/LegC7，酵母体内的内吞囊泡和ER来源囊泡的转运过程都受到了不同程度的干扰，表明其可能在军团菌体内发挥干扰宿主囊泡转运的功能[49]。
嗜肺军团菌Dot/Icm效应因子通过多种巧妙途径，“绑架”了宿主细胞调控囊泡转运的重要因子，从而达到形成LCV、逃避降解、稳定宿主细胞和体内增殖的目的。我们通过深入总结这一过程的参与因子及分子机制，了解了病原菌与宿主相互作用的诸多新方式。其中，以效应因子俘获宿主胞内Rab1蛋白的分子机制最具代表性和完整性。在整个俘获过程中，军团菌首先利用SidM完成对Rab1的识别，利用AnkX和Lem3辅助SidM解离Rab1-GDI复合物，利用SidM和LidA完成对Rab1的竞争性俘获和稳定，再通过SidM激活Rab1并对其进行AMP化修饰，在“绑架”后期，则利用SidD对Rab1进行去AMP修饰，促使LepB识别并水解Rab1-GTP，使Rab1重新回到活性关闭状态，并从LCV上脱离并被胞内游离的GDI回收，完成一个完整的膜循环(图 1)。整个过程精密有序，有助于我们细致了解病原菌俘获宿主囊泡转运的细节。然而，对Rab1的俘获和膜循环的调控，仅仅是嗜肺军团菌与宿主囊泡转运研究领域的冰山一角。2014年的最新研究成果，已经明确了LCV至少能俘获12种宿主Rab GTPases (Rab1，Rab2，Rab4，Rab5，Rab7，Rab8，Rab9，Rab10，Rab11，Rab14，Rab21，Rab32)[50]。基于嗜肺军团菌Dot/Icm分泌系统效应因子在细菌生理功能方面的研究地位和结构生物学在该领域的重要应用，我们亦尝试通过结构解析的手段，揭示这些可识别多种Rabs的效应因子如LidA和LepB的选择机制，以及军团菌编码带有真白序列基元的效应因子如AnkX和LubX的生物学意义。嗜肺军团菌Dot/Icm分泌系统分泌的多达300余种效应因子，尽管参与到军团菌感染、复制、增殖和自嗜的各个阶段，但多数效应因子的功能尚不明确，特别是那些参与调控宿主内质网到高尔基体转运、宿主细胞凋亡及自嗜的效应因子，目前仍是研究的热点，亟待引入新技术和巧妙构思去攻克研究难关。深入研究这些热点因子，对深入理解病原微生物的感染和致病过程，以及开展有针对性的预防和治疗，都具有重要的研究意义。